苯酚法测定可溶性糖

【原理】 植物体内的可溶性糖主要指能溶于水及乙醇的单糖和寡聚糖。苯酚法测定可溶性糖的原理是：糖在浓硫酸作用下，脱水生成的糠醛或羟甲基糠醛能与苯酚缩合成一种橙红色化合物，在10～100μg范围内其颜色深浅与糖的含量成正比，且在485nm波长下有最大吸收峰，故可用比色法在此波长下测定。苯酚法可用于甲基化的糖、戊糖和多聚糖的测定，方法简单，灵敏度高，基本不受蛋白质存在的影响，并且产生的颜色稳定160min以上。
【仪器 与用具】
分光光度计；电炉；铝锅；20ml刻度试管；刻度吸管5ml 1支，1ml 2支；记号笔；吸水纸适量。
【试剂 】
1．90%苯酚溶液 称取90g苯酚（AR），加蒸馏水10ml溶解，在室温下可保存数月；
2．9%苯酚溶液 取3ml 90%苯酚溶液，加蒸馏水至30ml，现配现用；
3．浓硫酸（比重1.84）；
4．1%蔗糖标准液 将分析纯蔗糖在80℃下烘至恒重，精确称取1.000g。加少量水溶解，移入100ml容量瓶中，加入0.5ml浓硫酸，用蒸馏水定容至刻度；
5．100μg/ml蔗糖标准液 精确吸取1%蔗糖标准液1ml加入100ml容量瓶中，加水定容。
【方法】
1．标准曲线的制作
取20ml刻度试管 11支，从0～10分别编号，按表24-1加入溶液和水。
表24-1 各试管 加溶液和水的量

管 号	0	1～2	3～4	5～6	7～8	9～10
100μg/ml蔗糖液(ml)	0	0.2	0.4	0.6	0.8	1.0
水(ml)	2.0	1.8	1.6	1.4	1.2	1.0
蔗糖量(μg)	0	20	40	60	80	100

然后按顺序向试管内加入1ml 9%苯酚溶液，摇匀，再从管液正面快速加入5ml浓硫酸，摇匀。比色液总体积为8ml，在恒温下放置30min，显色。然后以空白为参比，在485nm波长下比色测定，以糖含量为横坐标，光密为纵坐标，绘制标准曲线，求出标准直线方程。
2．可溶性糖的提取
取新鲜植物叶片，擦净表面污物，剪碎混匀，称取0.10～0.30g，共3份，或干材料。分别放入3支刻度试管中，加入5～10ml蒸馏 水，塑料薄膜封口，于沸水中提取30min（提取2次），提取液过滤入25ml容量瓶中，反复冲洗试管及残渣，定容至刻度。
3．测定 吸取0.5ml样品液于试管中（重复2次），加蒸馏 水1.5ml，同制作标准曲线的步骤，按顺序分别加入苯酚，浓硫酸溶液，显色并测定光密度。由标准线性方程求出糖的量，按下式计算测试样品中糖含量。
可溶性糖含量(mg/g)= [C×(V/a)×n]/(W×103)
式中 C－标准方程求得糖量(μg)；
a－吸取样品液体积(ml)；
V－提取液量(ml)；
n －稀释倍数；
W－组织重量（g）。


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